La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial que se aplica en la microbiologia para la visualización de bacterias, se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y las bacterias que se visualizan de color rosa o rojo se les considera bacterias Gram negativas.
Materiales y reactivos
Pipeta Pasteur.
Porta y cubre objetos.
Cristal violeta.
Lugol.
Alcohol-cetonico
Safranina.
Microscopio.
Aceite de inmersión.
Mechero Fisher.
Metodología
- Recoger muestras.
- Hacer el extendido en espiral.
- Dejar secar a temperatura ambiente.
- Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
- Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
- Enjuagar con agua.
- Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
- Enjuagar con agua.
- Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion)
- Enjuagar con agua.
- Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
- Enjuagar con agua.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
Tinción de Ziehl Neelsen
La tinción de Ziehl Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica,y se aplica para la identificación de microoganismos patógenos.
Fundamento
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.
Técnica
Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.
Metodología
Tinción Hematoxilina-eosina
Tinción de Ziehl Neelsen
La tinción de Ziehl Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y económica,y se aplica para la identificación de microoganismos patógenos.
Fundamento
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.
Técnica
Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.
Metodología
Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina.Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes:
- ácido periódico 58%
- carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:
- 0,5 g fucsina básica
- 50 cc agua destilada
- 5 cc etanol absoluto
- 28,5 g cristales de fenol derretidos
- hematoxilina
- alcohol ácido 1%:
- alcohol de 35º
- ácido clorhídrico
El procedimiento es el siguiente:
- desparafinar e hidratar los cortes
- ácido periódico 5%, 10 min
- lavar con agua destilada
- fucsina fenicada, 15 min
- decolorar en alcohol ácido al 50%
- lavar con agua destilada
- hematoxilina, 10 min
- azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
- deshidratar, aclarar y montar preparaciones.
Tinción Hematoxilina-eosina
La tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción hematoxilina y eosina es uno de los métodos mas populares de tinción utilizado en histología y medicina diagnostica.
El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y púrpura,como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.
Técnica
- Sumergir los preparados histológicos en xilol para eliminar los excesos de parafina.
- Luego pasan por una serie de alcoholes (100°. 95° y 70°).
- Se lava en agua para eliminar exceso de alcohol
- Se sumerge en hematoxilina por 10 minutos, luego se lava en agua para eliminar excesos y se pasa rápidamente por alcohol ácido.
- Se lava nuevamente
- Se sumerge 30 segundos en eosina.
- Se pasa por otra serie de alcoholes, en orden creciente (70°, 95° y 100°).
- Finalmente se deja remojar 10 minutos en xilol, antes de realizar el montaje final.
